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5 步教你跑出漂亮的大分子 WB 图诀窍
人阅读 发布时间:2017-10-23 09:54
Western Blot 操作步骤多,每个细节的差错都会造成图片不理想,那么怎么跑出漂亮的 Western Blot 图片?关注这五个步骤细节,教你跑出漂亮的大分子 western-blot 图,童鞋们赶紧来围观吧!
如果你的蛋白分子量大于 150 KD,但苦于一直跑不出好看的 western-blot,那么这篇文章,你一定得看。
选对凝胶很重要
3 种最常见的凝胶包括 Tris-Glycine, Bis-Tris and Tris-Acetate. Tris-Glycine 凝胶的 PH 为 8.6,且保质期很短。在跑胶的过程中,PH 还有上升的趋势,可达到 9.5。这会导致蛋白降解和低分辨率。
Bis-Tris 凝胶的 PH 为 6.4,相对 Tris-Glycine 凝胶,稳定性和保质期都有所增加。但这种凝胶需要在溶液中增加抗氧化剂,比如 DTT,以维持蛋白的还原性。
Tris-Acetate 凝胶的PH为7,跑大分子蛋白会呈现很高的分辨率。 跑大分子蛋白时,我们推荐使用 Tris-Acetate 凝胶。
凝胶浓度很重要
既然选择了 Tris-Acetate 凝胶,还有几个要考虑的问题。凝胶浓度与孔径成反比:浓度越小,孔越大。较大的蛋白质更容易通过较大的孔,所以我建议使用低百分比的凝胶,如 7%。可以使用梯度凝胶或非梯度凝胶,梯度凝胶非常适合新样本。
提高转移 buffer 中的 SDS,减少甲醇
转移buffer的组成至关重要。如果有甲醇存在,大分子蛋白很容易沉淀。通过减少转移 buffer 中的甲醇百分比(10% 或更低)来避免这种情况发生。 为了进一步确保蛋白质不会沉淀,考虑添加 SDS 至终浓度为 0.1%。SDS 向蛋白添加均匀的负电荷,使得它们更容易从凝胶转移到膜上。
选择合适的膜
膜一般有 PVDF 膜或 NC 膜。跑大分子蛋白选择 PVDF 膜。如前面所说,如果有甲醇存在,大分子蛋白很容易沉淀。而 PVDF 膜不需要在转移 buffer 中添加甲醇,目的蛋白转印的机会更高。两种类型的膜都有各种孔径尺寸,最常见的是 0.2 um 和 0.45 um。与凝胶一样,较大的蛋白比较小的更容易穿过大孔隙。大多数蛋白质(> 20 kDa)可以用 0.45 um 膜转移,避免使用 0.2 um 孔径。
增加转印时间
在正确的选择完凝胶、转印膜及转移 buffer 后,转印正式开始。半干转快且方便,但不适用于大分子蛋白。我建议湿转,因为大分子蛋白转移时间很慢,推荐 350-400 mA 转移 90 min 或 4°C,40 mA,转印过夜。
如果你的蛋白分子量大于 150 KD,但苦于一直跑不出好看的 western-blot,那么这篇文章,你一定得看。
选对凝胶很重要
3 种最常见的凝胶包括 Tris-Glycine, Bis-Tris and Tris-Acetate. Tris-Glycine 凝胶的 PH 为 8.6,且保质期很短。在跑胶的过程中,PH 还有上升的趋势,可达到 9.5。这会导致蛋白降解和低分辨率。
Bis-Tris 凝胶的 PH 为 6.4,相对 Tris-Glycine 凝胶,稳定性和保质期都有所增加。但这种凝胶需要在溶液中增加抗氧化剂,比如 DTT,以维持蛋白的还原性。
Tris-Acetate 凝胶的PH为7,跑大分子蛋白会呈现很高的分辨率。 跑大分子蛋白时,我们推荐使用 Tris-Acetate 凝胶。
凝胶浓度很重要
既然选择了 Tris-Acetate 凝胶,还有几个要考虑的问题。凝胶浓度与孔径成反比:浓度越小,孔越大。较大的蛋白质更容易通过较大的孔,所以我建议使用低百分比的凝胶,如 7%。可以使用梯度凝胶或非梯度凝胶,梯度凝胶非常适合新样本。
提高转移 buffer 中的 SDS,减少甲醇
转移buffer的组成至关重要。如果有甲醇存在,大分子蛋白很容易沉淀。通过减少转移 buffer 中的甲醇百分比(10% 或更低)来避免这种情况发生。 为了进一步确保蛋白质不会沉淀,考虑添加 SDS 至终浓度为 0.1%。SDS 向蛋白添加均匀的负电荷,使得它们更容易从凝胶转移到膜上。
选择合适的膜
膜一般有 PVDF 膜或 NC 膜。跑大分子蛋白选择 PVDF 膜。如前面所说,如果有甲醇存在,大分子蛋白很容易沉淀。而 PVDF 膜不需要在转移 buffer 中添加甲醇,目的蛋白转印的机会更高。两种类型的膜都有各种孔径尺寸,最常见的是 0.2 um 和 0.45 um。与凝胶一样,较大的蛋白比较小的更容易穿过大孔隙。大多数蛋白质(> 20 kDa)可以用 0.45 um 膜转移,避免使用 0.2 um 孔径。
增加转印时间
在正确的选择完凝胶、转印膜及转移 buffer 后,转印正式开始。半干转快且方便,但不适用于大分子蛋白。我建议湿转,因为大分子蛋白转移时间很慢,推荐 350-400 mA 转移 90 min 或 4°C,40 mA,转印过夜。
文章来自每日生物评论,更多实验技术详情欢迎关注微信:每日生物评论