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​ELISA 高背景的分析

发布时间:2017-10-12 14:49 |  点击次数:

摘要:ELISA 出现高背景还一脸懵逼!来看看你是怎样「中招」的吧! 今天就以出现高背景的情况作出详细的分析!



ELISA 实验过程中常常出现让人难以琢磨的结果。其中阴性对照出现高背景的情况也时有发生,这样导致结果不那么可性。出现高背景的原因可能如下。

1、抗体、抗体的浓度不合适

抗体质量不好,特异性不高可能会与封闭液(BSA)产生交叉反应,这点我遇到过,后来用 0.8% 的明胶代替,本底就很好了。
抗体亲和力不好,也会如此,由于加大了抗体的使用量,必然造成了非特异性增加的可能。

2、封闭液成分、封闭液的浓度、封闭时间

封闭液,如 BSA 可能与抗体发生交叉反应,导致背景偏高。
封闭液的浓度偏低,封闭时间过短,导致封闭不彻底,抗体与酶标板孔结合,也可能导致背景偏高。

3、孵育时间、孵育温度

孵育时间过长 、温度过高,也可能会导致非特异性结合增加,从而造成本底增高。

4、洗板液成分、洗板的时间

一般用 PBS 洗板就可以了,但有时候可以在洗板液中加入一些表面活性剂,如 tween-20.
洗板的时间不足,会导致抗体残留,引起阴性对照显色。如果是机洗,可以改为手洗少量尝试,增加洗板时间。机洗一般没有手洗去除干净。

5、显色时间

由于系统优化不好,导致样品显色较弱,而延长了显色时间,这样一来导致阴性对照也有部分显色。此时,应该优化检测系统,调整包被物、检测抗体、底物等的浓度,缩短显色时间,显色一般不超过 15 min。

6、样品

样品中含有干扰物质。此时可以优化系统,调整其他检测抗体的比例,而增加样品的稀释度、增加洗脱步骤等。

7、ELISA 板的选择

聚苯乙烯制备的 ELISA 板经射线照射后,其吸附性能特别是对免疫球蛋白的吸附性能增加,应用于双抗体夹心法可使固相上抗体量增多,但用于间接法测抗体时空白值较大。

与聚苯乙烯类似的塑料是聚氯乙烯。作为 ELISA 固相载体的一种,聚氯乙烯的特点为质软板薄,可剪割,价廉,但光洁度不如聚苯乙烯板,孔底亦不如聚苯乙烯平整。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高,但空白值也略高。

如下图,是分别使用两种不同厂家的 ELISA 做的同一种实验,背景完全不一样。



此外,配制时间过久的 CB 包被液,也会使样品和阴性对照的 OD 值稍微偏高,可能是由于放置太久,导致 CB 液的 pH 变化所致。