All-in-One™ miRNA qRT-PCR 系列试剂盒，快速、准确定量！

从1993年发现miRNA开始，有关miRNA的探索与发现就没有停止过。miRNA虽只有很短的一段核苷酸，却通过调控大量的靶基因，在基因表达中扮演了重要角色。小身体，大能量，说的就是它——microRNA（简称miRNA）。

miRNAs是一类长约20nt~24nt长度的单链小RNA，由细胞内源产生的发卡（hairpin）结构转录本加工而来。miRNAs的加工成熟是一个经历了细胞核到细胞质空间转变、多种酶和辅助蛋白协调完成的受到多层次调节的多步骤精密反应：1）DNA经过转录形成初级产物pri-miRNA；2）pri-miRNA在核内经Drosha酶剪切形成miRNA前体pre-miRNA；3）pre-miRNA转运至胞浆，经Dicer酶剪切形成成熟的miRNA。miRNA的功能主要是沉默靶基因表达：在RISC沉默复合体协助下，miRNA与其靶基因mRNA的3'-UTR（3'端的非翻译区）结合，抑制转录或诱导mRNA降解，从而抑制蛋白翻译。

因为miRNA的长度比较短，因此用常规的qPCR法很难对其直接定量。所以，在针对miRNA的PCR技术中，必须要延长待测miRNA的长度，构建出一个足够长的PCR模板，才能进一步应用PCR技术来定量分析。现在常用的对miRNA的定量方法主要有两种，分别为茎环引物法、加尾法。

颈环引物法

需要自己设计一种特殊的茎环结构的反转录引物，一般长度约为45bp。整个茎环法逆转录引物由两个部分组成：①通用的茎环结构，自身形成的茎环结构不仅能够有效地延长miRNA的逆转录产物长度，同时它自身互补的构象可以避免与其他同源基因结合，减少了非特异性扩增的几率。② 5~8个与目的miRNA的3’端反向互补的碱基。茎环结构的逆转录引物与miRNA 分子的3’端结合，并在逆转录酶的作用下进行反应，获得人为加长的miRNA第一链cDNA。

茎环反转录法利用可以正确折叠为茎环结构的引物对miRNA进行反转录，以获得人为加长后的miRNA cDNA第一链，然后利用合适的退火温度将反转录引物的茎环结构打开并与PCR扩增的正反向引物结合，再通过染料法或探针法进行荧光定量PCR检测。这种方法的特异性较高，但是对引物的要求也很高，需要引物在反转录阶段形成茎环式的正确构型，因此设计起来较为繁琐和困难。而且针对同一样本中不同的目的miRNA，就需要配制不同的逆转录体系。所以这种方法比较适合对样本中少量几个miRNA的精确定量检测。

加尾法

加尾反转录法利用poly(A)聚合酶为成熟的miRNA加上poly(A)尾巴，然后用5’端带通用标签的Oligo-dT作为反转录引物，获得人为加长的miRNA cDNA第一链，最后用与通用标签序列互补的反向引物进行染料法或者探针法的荧光定量PCR检测。这种方法可以批量地将所有成熟miRNA加上poly(A)尾巴，然后进行反转录和检测，无需繁琐的引物设计，因此被很多实验室采用。

作为NCBI推荐基因克隆供应商，Genecopoeia可为您提供基于加尾法的All-in-One™ miRNA qRT-PCR 系列试剂盒和验证引物，用于miRNA表达量的高效检测。

All-in-One™ miRNA qRT-PCR 系列试剂盒包括All-in-One™ miRNA qRT-PCR Detection Kit（miRNA检测试剂盒）、All-in-One™ miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit（miRNA逆转录试剂盒）和All-in-One™ miRNA qPCR Kit（miRNA定量试剂盒）。其中All-in-One™ qRT-PCR Detection Kit包括RT（逆转录）和qPCR（定量检测）两部分试剂，利用基于SYBR® Green的qPCR技术，可对低至20 pg的Total RNA（或者低至10 pg的small RNA）进行快速、准确定量。

miRNA qPCR定量检测试剂盒：

All-in-One™ miRNA系列试剂灵敏度高、特异性强、性价比高

• 可对检测低至20 pg的Total RNA（或者低至10 pg的small RNA）
• 仅检测成熟miRNA

验证引物

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All-in-One™ miRNA 验证引物

• 每条All-in-One™ miRNA 特异验证引物均使用专利算法设计并经过实验确证。
• 在miRNA定量PCR试验中，该系列验证引物与基于SYBR® Green I 的All-in-One™ miRNA qRT-PCR Kit配套使用，性能可靠，重复性好。

引物验证结果

Figure A	Figure B

All-in-One™ miRNA qPCR pimer经验证产生单一扩增产物，融解曲线均呈单一锐锋，电泳条带均呈单一条带，且与目标miRNA相符。由10种人组织混合样本的总RNA经逆转录形成的cDNA作为引物验证的模板。qPCR反应由终浓度0.2 µM的引物和All-in-One™ qPCR Mix配合完成。（A）验证结果的扩增曲线，（B）验证结果的熔解曲线。

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