活-死细胞染色试剂盒Live-Dead Cell Staining Kit（K501-100）操作步骤

细胞增殖和细胞死亡间平衡的维持对多种细胞有机的发育与生命的维持至关重要，其失衡将导致各种疾病的发生.如：人类平均每天有6×10（10）个新细胞生成，同时又接近同等数量的成熟细胞被机体清除.在细胞增殖及细胞凋亡间存在一种配对关系，因此区分活细胞和死细胞对研究生长条件的控制和细胞死亡过程都是十分重要的.

BioVision活-死细胞染色试剂盒提供了即用型试剂来方便地区分死细胞和活细胞.利用Live-Dye染料来对活细胞染色，这是一种能穿透细胞的绿色荧光染料（Ex/Em = 488/518 nm）.死细胞可以简单的用碘化吡啶（PI）染色，一种不能透过细胞膜的红色荧光染料（Ex/Em = 488/615）.染上色的活细胞和死细胞通过使用了滤光片（检测FITC和罗丹明）的荧光显微镜可以直接从视觉上区分开来.该试剂盒提供的试剂可以在24孔板上染色100次.

活-死细胞染色试剂盒Live-Dead Cell Staining Kit（K501-100）操作步骤：

（一）获得目的基因

1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。

2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。

（二）构建重组表达载体

1、活-死细胞染色试剂盒Live-Dead Cell Staining Kit载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。

2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。

（三）  获得含重组表达质粒的表达菌种

1、 将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。

2、 测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。

3、 以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。

（四）诱导表达

1、 活-死细胞染色试剂盒Live-Dead Cell Staining Kit挑取含重组质粒的菌体单斑至2ml LB（含Amp50μg/ml）中37℃过夜培养。

2、按1∶50比例稀释过夜菌，一般将1ml菌加入到含50mlLB培养基的300ml培养瓶中, 37℃震荡培养至OD600≌0.4-1.0（*0.6，大约需3hr）。

3、取部分液体作为未诱导的对照组,余下的加入IPTG诱导剂至终浓度0.4mM作为实验组,两组继续37℃震荡培养3hr。

4、分别取菌体1ml, 离心12000g×30s收获沉淀，用100μl 1%SDS重悬，混匀, 70℃10min。

5、离心12000g×1min，取上清作为样品,可做SDS-PAGE等分析。