SOS1 Ras GEF蛋白的应用和制备方法

SOS1 Ras GEF 蛋白应用领域：

1.SOS1 GTP交换活性抑制剂的研究

2.SOS1结合蛋白的鉴定

3.不同GTP酶对SOS1-GEF活性的研究

SOS1 Ras GEF蛋白材料：

人类SOS1交换域（564-1049）蛋白（SOS1 ExD）已在细菌表达系统中产生。重组蛋白的氨基末端含有一个6组氨酸标签（His标签）。SOS1 ExD蛋白的分子量约为61 kDa。蛋白质以冻干白色粉末的形式提供。

SOS1 Ras GEF 蛋白存储：

应通过添加33μl蒸馏水将蛋白质重组至50µM（3.03 mg/ml）。蛋白质将在以下缓冲液中：17 mM Tris pH 7.5、17 mM NaCl、0.2 mM MgCl2、2.3%蔗糖和0.3%右旋糖酐。为了保持蛋白质的高生物活性，强烈建议将蛋白质溶液分为“实验大小”的等份，并在液氮中快速冷冻。该蛋白质可在-70°C下储存6个月。避免反复的冻融循环。冻干蛋白质在4°C下干燥保存（湿度<10%）1年。

SOS1 Ras GEF 蛋白纯度：

蛋白质纯度通过在4-20%聚丙丨烯丨酰胺梯度凝胶上扫描考马斯蓝染色蛋白质的密度测定来确定。确定SOS1 ExD蛋白纯度>90%。

SOS1 Ras GEF 蛋白试剂：

1.重组Ras蛋白

2.重组SOS1 ExD蛋白（Cat.#GE02）

3.2倍交换缓冲液（40 mM Tris pH 7.5，100 mM NaCl，20 mM MgCl2，0.1 mg/ml BSA，1.5μM mant GTP）

4.稀释缓冲液（20 mM Tris pH 7.5，50 mM NaCl，10 mM MgCl2，0.1 mg/ml BSA）

SOS1 Ras GEF 蛋白方法：

1.用稀释缓冲液将SOS1 ExD蛋白（Cat#GE02）稀释至6μM（0.36 mg/ml）。

2.用稀释缓冲液将Ras稀释至50μM（1.1 mg/ml）。

3.将冻干的2x交换缓冲液溶解在5mL Milli-Q水中，并在室温下保存。

4.设置平板读取器进行动态荧光测量（激发波长为360 nm，发射波长为440 nm），每30秒读取一次，持续30分钟。

5.加入以下成分，轻轻移液混合：

交换反应混合物/96孔黑板

2倍交换缓冲液/50μl

dH2O/36μl

50μM Ras/4μl

6.在各自的孔中移取10μl 6μM SOS1 ExD蛋白质或稀释缓冲液，立即上下移取两次，并开始读取荧光。

7.一旦读数完成并保存了读板器文件，就可以使用读板器附带的软件将数据减少到Vmax来计算汇率。