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245 人阅读发布时间:2022-11-23 15:36
nickases内切酶背景:
CRISPR/Cas9 是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御系统,改造后的 II 型 CRISPR/Cas9 系统在基因的定点修饰中展现出巨大的应用潜能。脱靶效应是目前 CRISPR/Cas9 技术应用的一个难题,在基因编辑应用中,可能会出现难以预测的后果。
Cas9 Nuclease 具有两个切割活性中心,从而实现在 sgRNA 靶序列特定位点引入 DNA 双链断裂(DSB)。NLS-Cas9(D10A)Nickase 在 Cas9 Nuclease 基础上突变其中一个切割活性中心,其能在与 sgRNA 靶序列互补的DNA 链上产生切口,从而形成功能性的单链断裂,并且通过在蛋白两端加了核定位序列(NLS),可把蛋白送到细胞核内进行基因组编辑, 配合一对 gRNA 使用,可实现 Cas9 Nuclease 相同的基因编辑效果,由于有效的识别序列由 20 bp 增加至 40 bp,可明显减少意外的脱靶基因修饰,从而显著提高 CRISPR/Cas9 技术基因修饰的特异性。
艾美捷nickases内切酶特点:
纯蛋白体系,避免 CRISPR 基因敲除时引入质粒或病毒干扰; 可显著降低脱靶效应。
艾美捷nickases内切酶用途:
1,基于蛋白与 sgRNA 转染的非病毒载体 CRISPR 基因敲除;
2,基于蛋白与 sgRNA 转染的非病毒载体 CRISPR 基因敲入;
3,sgRNA 剪切靶点 DNA 效率检测,降低体内筛选成本;
4,体外剪切靶 DNA 的特异位点。
艾美捷nickases内切酶应用实例:

带有靶位点的超螺旋 DNA(cccDNA);
酶切产生切刻后的开环 DNA(ocDNA);
50 -100 ng 酶可有效切割 cccDNA(>95%)。
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