Caspase-1活性分析：艾美捷FAM-FLICA试剂盒解决方案

艾美捷Immunochemistry Caspase-1活性分析试剂盒背景：

半胱天冬酶不能切割FLICA抑制剂探针；相反它与靶上的FMK形成不可逆的共价键

并被抑制进一步的酶活性。信息和通信技术聚半胱天冬酶FLICA探针FAM-VAD-FMK可作为一种通用的检测细胞凋亡的试剂，因为它被许多类型的激活的胱天蛋白酶。更具体地靶向特定的胱天蛋白酶酶，使用ICT的专用FLICA试剂之一。ICT有套件用于检测：caspase-1（YVAD或WEHD）（也可识别Caspases 4和5）、-2（VDVAD）、-3/7（DEVD）、-6（VEID）、-8（LETD）、-9（LEHD）和-10（AEVD）。FLICA套件也有红色或远红色荧光标记。Caspases，像大多数其他关键细胞一样存活酶在目标氨基酸中有一定的容许性它们将识别并切割的序列。尽管FLICA试剂含有各自优选的不同氨基酸靶序列caspase，它们也可以识别其他活性caspase

存在。

FLICA可用于标记悬浮或粘附细胞组织切片。用FAM-FLICA标记后，细胞可以固定或

冻结的对于标记后将被石蜡包埋的组织，使用ICT红色硫罗丹明SR-FLICA探针；不要使用绿色FAM-FLICA探针作为FAM染料将在石蜡包埋过程中淬灭。用FAM-FLICA标记的细胞可以用试剂进行反染色例如红色活/死染色物碘化丙啶（包括在FAMFLICA试剂盒中）和7-AAD（目录#6163）坏死。核形态可以同时使用Hoechst 33342，一种蓝色DNA结合染料（包括在FLICA试剂盒中）。细胞可以通过荧光显微镜直接观察，或者荧光强度可以被量化使用流式细胞仪或荧光平板读取器（图8）。FAM-FLICA最佳激发波长为488-492nm峰值发射在515-535nm。  

艾美捷Immunochemistry Caspase-1活性分析试剂盒组分：

试验尺寸套件包含：

•1瓶FAM-FLICA胱天蛋白酶抑制剂试剂

•1瓶10X凋亡洗涤缓冲液（15 mL），#635

•1瓶固定剂（6 mL），#636

•1小瓶碘丙啶，250µg/mL（1 mL），#638

•1小瓶Hoechst 33342，200µg/mL（1 mL），#639

标准尺寸套件包含：

•4瓶FAM-FLICA胱天蛋白酶抑制剂试剂

•1瓶10X凋亡洗涤缓冲液（60 mL），#634

•1瓶固定剂（6 mL），#636

•1小瓶碘丙啶，250µg/mL（1 mL），#638

•1小瓶Hoechst 33342，200µg/mL（1 mL），#639。

将未开封的套件和每个未开封的组件储存在2-8°C，直到到期日期。一旦用DMSO重新配制，立即使用FLICA，或在≤-20°C的温度下储存6个月，避光，解冻时间不超过在这段时间内两次。

艾美捷Immunochemistry Caspase-1活性分析试剂盒实验准备:

用FLICA染色细胞可以在几个小时内完成。然而FLICA用于活细胞，需要定期维护和提前几天栽培。此外，一旦正确的数字已经培养了个细胞，必须为实验分配时间治疗或半胱天冬酶激活过程。创建细胞群，例如：

a、 暴露于实验处理的细胞

b、 接受安慰剂的阴性对照细胞群治疗

当FLICA检测到催化活性形式的胱天蛋白酶时酶，计划实验，以使FLICA在细胞中预期胱天蛋白酶被激活时被稀释和给药。30X FLICA的推荐体积为每300µL细胞10µL3-5 x 105细胞/mL，但数量可能因实验而异条件和用于分析的仪器。每位研究者应调整FLICA的量以适应特定细胞系研究条件。

将细胞培养至适合特定实验条件的最佳密度或凋亡诱导方案。细胞密度不应超过106细胞/

超过此浓度培养的细胞可开始自然生长进入凋亡。可能需要进行初步实验来确定何时以及使用多少FLICA作为产生的正信号是培养过程中caspase活性的直接测量时期.

图：Jurkat细胞（T淋巴细胞）用ICT的绿色FAM-LICA标记聚半胱天冬酶抑制剂FAM-VAD-FMK（试剂盒#92）显微镜荧光。灰色DIC图像（B）显示了但其中只有四个发出绿色荧光（A）。四个（共个）5个细胞凋亡，并存在活性胱天蛋白酶（绿色）。

来源：https://www.amyjet.com/products/ICT-97.shtml