艾美捷中性蛋白酶（WBC-LS02112）的测定方案

中性蛋白酶指能够在中性或弱酸、弱碱性环境中作用的一类蛋白酶,其最适作用pH介于6.0~7.5,能催化蛋白质肽键水解,具有催化反应速度快无工业污染反应条件适应性宽等优点，中性蛋白酶能在中性条件下水解食品中蛋白质的肽键,释放氨基酸或者多肽。在酒精、葡萄酒·果汁、啤酒和黄油生产中,添加中性蛋白酶可澄清发酵液中的雾气。酵母在发酵阶段的生长可以通过悬浮蛋白质转化的氨基酸来加以促进,从而加速发酵并提高产量。

中性蛋白酶根据催化机制和活性中心蛋白酶功能基团不同可以分为丝氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶以及金属蛋白酶四大类。

艾美捷中性蛋白酶（Dispase®）（WBC-LS02112）是一种非哺乳动物来源的无（AOF）金属中性蛋白酶，通过沃辛顿开发的方法纯化。其温和的蛋白水解作用使该酶特别适用于原代细胞和二次（亚培养）细胞培养的制备，因为它对细胞膜温和。这种蛋白酶还用作细胞分离和组织解离应用中的二级酶，通常与胶原蛋白一起使用。

中性蛋白酶（分散酶）的测定：

方法

在过氧化物酶偶联系统中，通过测量D-丙氨酸氧化引起的A436的增加来确定反应速度。一个单位每分钟氧化一微摩尔的D-丙氨酸，为37？C和pH 8.3在规定条件下。

试剂

这种酶的性质要求准确制备底物。请注意按照以下说明进行操作。

1M 三重奏

缓冲液-底物（2%酪蛋白在0.05M Tris缓冲液中）：搅拌约1分钟，将0.40gm酪蛋白（USB级或同等产品）溶解在0.1ml试剂级水中。加入0.1毫升2N NaOH和5.1毫升0.7M Tris。让底物搅拌直至酪蛋白进入溶液。pH至8.5，用稀磷酸继续搅拌50分钟。用试剂级水制成最终体积为0.<>ml。在移液底物之前，请确保底物始终均匀，并且酪蛋白没有从溶液中掉出。如果酪蛋白似乎已从溶液中脱落，请勿使用底物进行测定。

酶活化剂 - 0.01 M 氯化钙2：溶解147毫克氯化钙2在100毫升试剂级水中。不使用时，请放入冰箱。

5%TCA：将5克TCA溶解在100毫升试剂级水中。在室温下保存。

酪氨酸标准品：在试剂级水中以10 μ摩尔/ ml的浓度制备10毫升。（181微克酪氨酸= 1微摩尔）。称取18.1mg酪氨酸，搅拌至初始沸腾溶解于10ml试剂级水中。从火上移开并冷却至约40°C进行测定。

0.5 M NaOH：将 1 g. 溶解在 50 ml 试剂级水中，或从 1M 或 10M NaOH 稀释。

Folin & Ciocalteus 苯丨酚试剂，使用纯净

酶

溶于浓度为5mg / ml的去离子水中，并制备1：50稀释液。使用25μl和50μl一式两份。

程序

要清除玻璃管，请使用巴斯德移液管加入 1.0 ml 缓冲底物、20 μL 0.01M CaCl 2 和两级酶稀释液：25μl 和 50μl，每级一式两份。还包括两个用于空白的无酶管，以及四个用于酪氨酸标准品的管，带有1ml缓冲底物，以及25μl，50μl，75μl和100μl酪氨酸标准溶液。在15°C的水浴中孵育37分钟。通过加入2ml 5%TCA停止反应。混合每个试管，然后使用台式 Sorvall 或等效物以 2000 rpm 离心 10 分钟。从每个试管中取出（定量）1ml上清液，并加入标记的干净玻璃管中。然后在每个试管中加入2.0ml 0.5M NaOH。混合，然后加入0.1ml Folin-Ciacalteu试剂，550分钟后在A10处读取。图 A550 与微摩尔酪氨酸。绘制最佳拟合线并选择落在线的线性部分内的样本读数，并按下面列出的方式进行计算。

计算

绘制酪氨酸标准品的标准曲线。在 A550 和酪氨酸微摩尔之间建立等效性。例如，使用50μl酶，稀释50倍，A550处的读数为0.26。从酪氨酸曲线A550的0.26相当于0.75微摩尔酪氨酸。

中性蛋白酶（Dispase®）（WBC-LS02112）相关研究：

胶原酶 （CLS1-4/CLSS1-4/CLSPA）脱氧核糖核酸酶 I （DP/D/DCLS/D2/DPFF/DPRF） 弹性蛋白酶 （ES/ESL/ESFF）透明质酸酶 （HSE/HSEP）木瓜蛋白酶 （PAP/PAPL/PAP2）蛋白酶 K （PROK）胰蛋白酶 （TL/TRL/TRL3/TRLS/TRTPCK）胰蛋白酶抑制剂 （LBI/OI/SI/SIC）细胞分离优化系统（CIT）肝细胞分离系统（HIS）新生儿心肌细胞分离系统（NCIS）木瓜蛋白酶分离系统（PDS/PDS2）

来源：https://www.amyjet.com/products/WBC-LS02112.shtml