兔抗ATR抗体亲和纯化正在热销，超值抢购

本文系统介绍由艾美捷Bethyl Laboratories推出的靶向人ATR蛋白的兔源多克隆抗体（货号A300-137A）的核心技术参数、标准化操作流程及功能应用要点，适用于DNA损伤应答、复制胁迫响应及细胞周期检查点调控等研究领域。

一、产品基本特性

该抗体为兔多克隆抗体，以全IgG形式提供，未经标记修饰。其特异性靶点为ATR（共济失调毛细血管扩张症与Rad3相关蛋白，又称丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶ATR），仅识别人源样本，适用于人类细胞系或组织裂解物的检测。

抗体经抗原亲和纯化处理：通过固相载体上固定的ATR特异性表位进行吸附洗脱，有效去除血清中的非特异性IgG，确保高纯度与低背景。免疫原对应人ATR蛋白第400至450位氨基酸区域（参考序列NP_001175.1，基因ID 545）。该表位位于蛋白N端附近，避免了与ATM、DNA-PKcs等其他PI3K家族激酶的交叉识别。

抗体浓度标定为1000 µg/ml（采用比尔定律测定，1 mg/ml IgG在280 nm处吸光度为1.4）。总蛋白量未标注，可根据实际需要按量取用。

二、储存与缓冲体系

储存条件：2 – 8°C冷藏，严禁冷冻。反复冻融会破坏抗体天然构象，导致效价下降或形成聚集体。

有效期：收货之日起1年。未开封且严格避光、避免温度波动的情况下可维持完整活性。

缓冲液组成：Tris-枸橼酸/磷酸缓冲液，pH 7–8，含0.09%叠氮钠作为抗菌防腐剂。

关键注意事项：叠氮钠会共价修饰HRP的酪氨酸残基，不可逆抑制酶活性。若后续使用HRP标记二抗进行化学发光检测，必须通过充分洗涤（至少5次，每次5分钟）去除叠氮钠；或选用不含叠氮钠的配方（如含0.02%硫柳汞的PBS）。对于直接偶联HRP的一抗，本产品不适用。

三、推荐应用与操作流程

1. 免疫沉淀 (IP)

抗体用量：6 µg抗体 / mg总蛋白裂解物。通常一个10 cm培养皿的贴壁细胞（80–90%融合度）总蛋白量约1–2 mg，需添加12 µg抗体。

裂解液选择：推荐使用非变性IP裂解缓冲液（如50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5% NP-40 或 0.3% CHAPS）。由于ATR是核内蛋白且与染色质紧密结合，建议裂解前用低盐缓冲液预洗细胞，裂解后辅以Benzonase核酸酶（25 U/ml）或超声处理（功率30%，5秒脉冲/5秒间隔，共1分钟），以释放染色质结合的ATR。

操作步骤：抗体与澄清裂解液于4°C旋转孵育2小时至过夜（过夜有利于低丰度蛋白富集）。随后加入Protein A/G磁珠（或琼脂糖珠），继续孵育1–2小时。磁珠用裂解缓冲液洗涤3–5次后，加入SDS-PAGE上样缓冲液煮沸变性。

2. 蛋白质印迹 (WB)

工作稀释度：1:2000 – 1:10,000。初次实验建议从1:2000开始；若信号过强或背景升高，可逐步稀释至1:5000或1:10000。

凝胶体系：3–8% Tris-醋酸凝胶（必需）。ATR分子量极大（约300 kDa），常规Tris-甘氨酸凝胶无法有效分离高分子量蛋白，易导致条带拖尾或完全无法转入膜。Tris-醋酸体系配合低浓度丙烯酰胺可提供更好的大分子分辨率。

封闭与稀释液：含5%脱脂奶粉的TBST（Tris-缓冲盐 + 0.1% Tween-20）。避免使用BSA，因其可能引入非特异性背景。

一抗孵育：4°C过夜（12–16小时）。短时室温孵育不足以检测低丰度核蛋白。

二抗选择：

细胞裂解物直接WB：使用山羊抗兔IgG（H+L）HRP二抗（如A120-101P），按说明书推荐稀释度（通常1:5000–1:20000）。

IP后WB检测：免疫沉淀洗脱物中包含兔IgG重链（约55 kDa）和轻链（约25 kDa）。由于ATR分子量为300 kDa，远高于重链和轻链，常规抗兔全IgG二抗不会产生干扰。但若同时检测ATR的磷酸化修饰或低分子量的共沉淀蛋白，建议使用抗兔IgG轻链特异性HRP二抗，并在封闭缓冲液中加入5%正常猪血清（货号S100-020）以封闭非特异性Fc受体。

转膜条件：建议使用0.45 µm PVDF膜（硝酸纤维素膜易脆且对大分子结合效率低）。湿转法：100 V，2.5小时（冰浴）或 30 V，4°C过夜。甲醇浓度控制在5–10%之间，过高会导致大蛋白沉淀。

分子量预期：全长ATR约300 kDa，可能出现降解条带（~250 kDa、150 kDa），属常见现象，尤其在蛋白酶抑制不足或反复冻融样本中。

四、靶点功能与生物学背景

ATR是磷脂酰肌醇3激酶相关激酶家族（PIKK）的核心成员，与ATM、DNA-PKcs同源。不同于ATM主要响应DNA双链断裂，ATR更专一地感知DNA复制胁迫和紫外线损伤。当复制叉停滞或单链DNA暴露时，ATR通过其相互作用蛋白ATRIP（ATR相互作用蛋白）结合RPA包被的单链DNA，进而被激活。

ATR激酶通过磷酸化下游底物启动检查点信号通路，介导细胞周期阻滞（S期和G2/M期）、复制叉稳定、DNA修复或凋亡。已知底物包括：

BRCA1（调控同源重组）

p53（诱导细胞周期阻滞或凋亡）

Chk1（关键效应激酶，触发S期和G2/M期检查点）

Rad17（加载PCNA样复合物至损伤位点）

E2F1（调控转录）

ATR基因突变可导致塞克尔综合征（Seckel syndrome，表现为小头畸形和侏儒症）以及更广泛的DNA损伤应答缺陷。ATR抑制剂已在肿瘤治疗中进入临床试验，用于联合PARP抑制剂或化疗药物协同杀伤复制应激高的癌细胞。

五、别名与同源性

该抗体识别人ATR蛋白的400–450残基，该区域在哺乳动物中具有较高的保守性，但反应性仅验证为人，不推荐用于小鼠、大鼠或其他物种，除非经序列比对验证100%一致。

常见别称：

共济失调毛细血管扩张症与Rad3相关蛋白

FRAP相关蛋白1（FRP1）

MEC1同源物

SCKL1（塞克尔综合征1型）