96孔ROCK活性检测试剂盒效果稳定，正在热销！

一、产品概述与核心原理

由艾美捷代理Cell Biolabs推出的96孔ROCK活性检测试剂盒（货号STA-416，96次规格）是一款基于酶联免疫原理开发的非同位素检测工具，用于定量分析Rho相关卷曲螺旋激酶（ROCK）的活性水平。ROCK是Rho信号通路下游的关键效应分子，通过磷酸化多种底物调控肌动蛋白骨架重组，参与细胞迁移、黏附及胞质分裂等核心生物学过程。其中，ROCK对肌球蛋白磷酸酶靶向亚基1（MYPT1）Thr696位点的特异性磷酸化，是调节肌球蛋白轻链（MLC20）磷酸化水平及细胞收缩功能的关键环节。

本试剂盒采用重组MYPT1预包被的96孔板，待测样本中的ROCK（纯化激酶、细胞裂解液或组织匀浆）在ATP存在下催化MYPT1磷酸化，随后利用特异性抗磷酸化MYPT1（Thr696）抗体进行检测，通过HRP标记二抗及显色反应实现信号放大与定量。检测灵敏度可达200 pg活性ROCK-II，并配备重组活性ROCK-II作为阳性对照。

二、适用场景与核心优势

本试剂盒适用于以下典型研究场景：

1. ROCK活性定量分析：测定不同细胞类型、组织样本或病理状态下ROCK的基础活性水平

2. ROCK抑制剂筛选与评价：对比化合物处理前后磷酸化信号变化，评估候选药物的抑制效价（IC₅₀）

3. Rho/ROCK信号通路机制研究：结合上游Rho激活剂（如LPA）或沉默干预，解析信号传导调控网络

4. 疾病模型相关性分析：在心血管疾病、癌症转移、神经退行性疾病等ROCK通路异常活化模型中开展机制验证

核心优势：

非放射性检测：避免同位素操作的安全隐患与实验限制

生理底物设计：使用全长重组MYPT1，更真实反映体内磷酸化事件

高灵敏度与特异性：专用磷酸化位点抗体确保信号特异性，避免交叉反应

96孔高通量平台：标准微板兼容自动化洗板与读板系统，支持批量样本同步分析

三、操作流程与关键参数

核心步骤：

将ROCK样本（建议预稀释）加入MYPT1预包被孔中，同时加入ATP启动磷酸化反应，37°C孵育适当时间

洗涤去除未结合组分后，加入抗磷酸化MYPT1（Thr696）一抗孵育

洗涤后加入HRP标记二抗孵育，再次洗涤

加入显色底物避光反应，终止液终止后于450 nm读取吸光度

通过阳性对照ROCK-II建立参考信号范围，待测样本活性以相对磷酸化水平或标准曲线定量表示

关键质控点：

样本制备需全程保持低温（4°C），并添加蛋白酶/磷酸酶抑制剂防止蛋白降解及磷酸化状态改变

建议设置无ATP对照孔排除背景磷酸化，设置无样本空白孔校正基质干扰

磷酸化反应时间需通过预实验确定线性范围，避免信号饱和

每步洗涤需充分但轻柔，防止包被底物脱落

四、试剂盒组分与储存要求

本试剂盒分两个包装运输：

Box 1（室温运输，收货后4°C保存）：

-ROCK底物预包被板（96孔可拆条）：重组MYPT1包被

-激酶缓冲液（10×）20 mL

-ATP溶液（100 mM）100 µL（需-20°C保存）

-抗磷酸化MYPT1（Thr696）抗体20 µL

-HRP标记二抗20 µL

-检测稀释液50 mL、洗涤缓冲液（10×）100 mL、显色底物液12 mL（避光）、终止液12 mL

Box 2（蓝冰运输，收货后-80°C保存）：

-活性ROCK-II阳性对照20 µL（10 ng，含保护蛋白BSA及甘油）

储存要点：

活性ROCK-II必须存放于-80°C，避免反复冻融（建议分装单次使用量）

ATP溶液于-20°C保存，其余组分（除酶和ATP外）于4°C保存

显色底物需避光保存，使用前平衡至室温

五、关联产品推荐

为构建完整的Rho家族信号通路研究体系，建议搭配以下试剂盒：

STA-415：ROCK活性免疫印迹试剂盒（适用于传统Western blot验证）

STA-400：Ras活化检测试剂盒

STA-404：Rac/Cdc42活化检测组合试剂盒

STA-405：Rho/Rac/Cdc42活化检测组合试剂盒

STA-410：PAK1 PBD琼脂糖珠（用于Rac/Cdc42 pull-down实验）

实验结果解读需结合样本蛋白浓度归一化处理，并设置阳性（活性ROCK-II）与阴性（无ATP或热失活样本）对照确保数据可靠性。对于抑制剂筛选实验，建议设置梯度浓度并计算IC₅₀值，同时注意排除化合物对HRP显色系统的直接干扰。

文献参考

1. Etienne-Manneville, S., and Hall, A. (2002) Nature 420, 629-635.

2. Riento, K., and Ridley, A. J. (2003) Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 4, 446-456.

3. Leung, T., Manser, E., Tan, L., and Lim, L. (1995) J. Biol. Chem. 270, 29051-29054.

4. Matsui, T., Amano, M., Yamamoto, T., Chihara, K., Nakafuku, M., Ito, M., Nakano, T., Okawa,K., Iwamatsu, A., and Kaibuchi, K. (1996) EMBO J. 15, 2208-2216.

5. Totsukawa, G, et al., J. Cell Biol. (1999) 144, 735-744.